旗津早年稱為旗後，是高雄發跡最早的地區，也是許多外國貿易商設置據點。當時，英國長老教會海外宣道會差派宣教師馬雅各醫生，來台灣宣教，當時由於人民排外仇教，在台灣傳教困難重重，馬雅各醫生於是在通山街(高雄第一街)朝日鐵工廠處租一間店面傳道醫病。1865年馬雅各醫生在旗津後山腰(高雄燈塔下的台灣機械廠修船塢處)買地興建簡易醫館、並設置禮拜堂，不僅是台灣第一個西醫醫館，也是台灣基督長老教會第一間禮拜堂，當時稱為「打狗禮拜堂」，基督教傳教師就以旗後教會為根據地展開傳教工作，國外商人都到此做禮拜，是旗後教會的前身。馬雅各以精湛的外科技術為南部居民治好瘧疾、眼疾等病痛，逐漸獲得當地居民的信任，也開始接受基督教。教會現址歷經風災地震的滋擾，造成多處損害，涉及安全問題，2009年12月中旬拆除進行改建，在這段期間，教會將於當地先行租屋以做為教會會址，完工後，會以全新面貌繼續為大家服務。